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分秒必爭,賽默飛Orbitrap質譜參與全球xin冠抗疫研究

2020/5/28提供者: 賽默飛世爾科技(中國)有限公司 人氣指數:1226 進入該公司展臺

 分秒必爭,賽默飛Orbitrap質譜參與全球xin冠抗疫研究

                                                                              關注我們,更多干貨驚喜好禮

    賽默飛世爾,作為全球抗疫先鋒之一,在背后助力全球科學家的研究,守護我們的健康 ,讓世界更安全。

由SARS-CoV-2(2型嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒)引起的新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease-19)具有高傳染性,新型冠狀病毒肺炎在中國和國際的迅速傳播引發了全球衛生緊急情況。全球ding尖的科學家針對xin冠病毒進行爭分奪秒的研究,利用Orbitrap質譜技術參與分析病毒相關蛋白結構,病毒感染機制等內容,本文將討論Orbitrap高分辨質譜在xin冠病毒感染致病等機制的全球亮點研究及技術進展。

 

1. 靶向蛋白定量方法監測xin冠病毒蛋白動態變化

Orbitrap Eclipse高靈敏度平行反應監測靶向定量xin冠病毒蛋白

2019年美國質譜年會,賽默飛重磅推出三合一系列的創新巔峰之作——Thermo ScientificTM Orbitrap EclipseTM 質譜儀,旨在解決生物學研究中的分析難題,輕松應對蛋白質組學,生物制藥與蛋白質高級結構分析研究中的各項挑戰,推出不久即投入到xin冠病毒研究中。

最近,荷蘭鹿特丹伊拉斯馬斯大學研究團隊使用 Orbitrap Eclipse檢測SARS-CoV-2病毒蛋白肽段序列,作為潛在的診斷工具。作者利用easy1200液相和Eclipse質譜使用靶向方法-平行反應監測(PRM)追蹤病毒感染Vero細胞后,幾種SARS-CoV-2蛋白的肽段變化。作者研究了SARS-CoV-2蛋白PRM實驗的檢測限,主要核衣殼蛋白(NCAP),這是最豐fu的病毒蛋白,因此是比較好的候選測試分子。Orbitrap Eclipse 質譜的PRM結果顯示對該蛋白靈敏度可達到amol級別大約為0.9pg。粗略計算表明,這種靈敏度水平應足以檢測理論上與約10000個SARS-CoV-2顆粒相對應的蛋白量。其他SARS-CoV-2蛋白也是PRM靶向方法的良好候選蛋白[1]


圖. Orbitrap Eclipse靶向PRM監測SARS-CoV-2病毒蛋白肽段序列

此外作者還在進行了整體蛋白質組學分析。在60-90分鐘分析時間內,鑒定出6500種相關蛋白質。這表明蛋白質組學可以用來研究病毒感染宿主細胞的蛋白質組,是未來新興的研究工具。

2蛋白質組學研究xin冠病毒感染的調控機制研究

2.1 Orbitrap 高分辨質譜研究病毒宿主相互作用蛋白揭示感染機制

SARS-CoV-2病毒的基因組有29811個核苷酸,編碼28-29個蛋白質。其中一個蛋白質E 是一種包膜蛋白,有助于形成病毒油泡的結構蛋白。一旦病毒進入細胞,它還有其他的功能。例如,附著在蛋白質上,有助于打開和關閉我們自己的基因。當E蛋白干擾時,模式可能會改變。VISTARA BIOSCIENCE研究人員最近進行一項研究發現,蛋白質E與寄主細胞中的溴多胺蛋白結合。Bromodomain 4(BRD4)是BET亞家族蛋白,通過識別乙酰化組蛋白提供了一個招募平臺作用,與非組蛋白靶點相關,除與病毒蛋白復合外,還參與NFKB信號轉導、Myc調控。此外,BRD4還與其它bromodomain蛋白存在協同作用,其中一些還可能執行泛素化功能。另有一位作者使用QE HFX質譜描述了BRD4相互作用蛋白的分子表型,使用了經BET抑制劑、與BRD4結合的化合物以及可能的其他bromodomain蛋白處理的人類B細胞系蛋白質組結果發現,已鑒定的蛋白定位于SARS-CoV-2病毒感染細胞的相互作用重編程途徑和復合物中[2],如下圖所示

圖. 蛋白組學分析SARS-CoV-2病毒感染細胞BRD4相關互作蛋白

2.2. Q Exactive HF質譜非標定量技術監控病毒感染細胞實時變化

法國巴黎薩克利大學團隊,通過使用Thermo ScientificTM Orbitrap Q Exactive HFTM質譜進行鳥qiang蛋白質組學研究,獲得了 SARS-CoV-2感染的相關信息,確定病毒顆粒抗原產生的最jia條件。技術流程如下圖所示。

作者用SARS-CoV-2感染Vero E6細胞(MOI 0.01和0.001)。然后用LFQ(非標記定量方法)方法在幾天內監測感染的實時變化總共鑒定了3220個Vero細胞蛋白和6個SARS-CoV-2蛋白,以及27388個Vero細胞和94個病毒特異肽段(FDR<1%)。病毒蛋白水平在不同時間點的動態變化表明,SARS-CoV-2蛋白合成在感染后持續增加,在感染第3天左右達到最大值。為了評估質譜獲得的病毒圖譜在多大程度上反映了病毒的產生,作者通過qPCR在同一時間點測量了SARS-CoV-2 RNA分子觀察到了極為富的病毒蛋白產量的變化[3],從而證實可以使用基于質譜的LFQ非標定量法監測SARS-CoV-2感染動力學。

 

圖. Q Exactive HF質譜進行鳥qiang蛋白質組學研究SARS-CoV-2感染的相關蛋白

3. Orbitrap高分辨質譜針對xin冠病毒糖蛋白結構研究進展

3.1Orbitrap Fusion質譜結合冷凍電鏡解析SARS-CoV-2 S糖蛋白多糖結構

來自CCRC的Robert Woods實驗室通過大量實驗生成了 SARS-CoV-2 S糖蛋白上的聚糖三維結構。整個研究基于報道的S蛋白3D結構和相關的糖組學數據[4],由賽默飛冷凍電鏡Cryo_EM 以及Thermo ScientificTM Orbitrap FusionTM 質譜結合分析

他們進行了分子動力學模擬,以觀察多糖的微觀異質性對表位暴露的影響。模糊位置為聚糖結構。M9(綠色),M5(深黃色),混合(橙色),復合(粉色)。

 

圖. SARS-CoV-2 S糖蛋白聚糖結構和多糖微觀異質性

3.2. Orbitrap Fusion Lumos質譜繪制xin冠病毒SARS-CoV-2 S蛋白糖基化圖譜

新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)中的刺突蛋白(Spike蛋白)是一種高度糖基化的蛋白質,是病毒結合和進入宿主細胞的關鍵調節因子,也是研發抗體及相關藥物的關鍵靶點。該蛋白的位點特異性N-糖基化修飾(包含糖基化位點糖鏈信息)分析對于了解其功能和藥物研發具有重要意義。四川大學華西醫院科研團隊針對該蛋白的位點特異性N-糖基化修飾進行深入分析[5],具體實驗流程如下。

圖. 利用Orbitrap質譜分析xin冠病毒S蛋白N-糖基化流程

 

 通過使用Thermo ScientificTM Orbitrap FusionTM LumosTM質譜技術的整合糖蛋白質組學新方法,繪制了xin冠病毒SARS-CoV-2重組表達蛋白的所有N糖基化修飾位點以及位點特異性的N-糖鏈組成圖譜,如下圖所示。

圖. S糖蛋白位點特異性N糖基化位點修飾譜

4. 蛋白質組結合代謝組研究xin冠病毒感染病人血清生物標志物

多組學方法研究xin冠肺炎輕重癥患者血清中蛋白和代謝生物標志物

西湖大學生命科學學院與合作團隊對xin冠肺炎患者血液中的蛋白質和代謝物分子進行系統檢測,利用多組學方法研究重癥患者血清的多種蛋白和代謝物分子表型,尋找潛在生物標志物,有望為預測輕癥患者向重癥發展提供導向。

實驗對99病毒滅活處理的血清樣本進行了安全處理和Orbitrap質譜分析。根據現行臨床診斷標準,樣本被分為對照(健康)組、普通流感組、xin冠感染輕癥組、xin冠感染重癥組。運用QE HF質譜對血清樣本中的蛋白和代謝物的相對濃度進行整體分析[6],揭示重癥患者體內多種分子調控,具體流程如下圖所示。

圖. 蛋白質組學結合代謝組學圍繞xin冠肺炎患者隊列進行分析流程

 

與對照(健康)組、普通流感組和輕癥組相比,xin冠肺炎重癥患者的樣本中出現了93種特有的蛋白表達和204個特征性改變的代謝分子。其中50種蛋白,與患者體內的巨噬細胞、補體系統、血小板脫顆粒有關。研究團隊還發現,在xin冠病毒感染的重癥患者體內,有100多種氨基酸及100多種脂質均顯著減少。見下圖。

圖. Corona Virus Disease-19感染后重癥患者體內的巨噬細胞等通路蛋白質和代謝物變化

基于Orbitrap質譜技術和機器學習分析方法,短時間內整合蛋白質組、臨床、生物、代謝組、計算等多學科數據篩選出重癥患者特征性的22個蛋白質和7個代謝物,有望可以輔助現有的診斷分析手段,實現更精準、高效的治療。

 

新型冠狀病毒肺炎疫情來勢洶洶,牽動著每一個人的心,在這沒有硝煙的抗疫戰場上,白衣天使和醫學研究者都是勇敢的戰士賽默飛也在以自己的力量全力支持國內的xin冠病毒科學研究,我們整理了基于Orbitrap超高分辨質譜技術在xin冠病毒相關的全球亮點研究,謹以此文致敬白衣天使和深耕醫學研究的學者們,默默付出,勇敢向前。

 

參考文獻

[1] TARGETED PROTEOMICS FOR THE DETECTION OF SARS-COV-2 PROTEINS,  網zhi:biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.23.057810v1

[2] A proteomic model of SARS-COV2 infection by comparing the interactomes of BRD4 with BET-inhibition and SARS-COV2 viral proteins – implications for re-purposing approved drugs or ubiquitin-mediated degradation of select candidatesDOI:10.21203/rs.3.rs-24573/v1

[3] Shotgun proteomics of SARS-CoV-2 infected cells and its application to the optimisation of whole viral particle antigen production for vaccines, 網zhi:biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.17.046193v1

[4] 3D Models of glycosylated SARS-CoV-2 spike protein suggest challenges and opportunities for vaccine development, doi: 網zhi:doi.org/10.1101/2020.04.07.030445

[5] Site-specific N-glycosylation Characterization of Recombinant SARS-CoV-2 Spike Proteins using High-Resolution Mass Spectrometry, 網zhi:doi.org/10.1101/2020.03.28.013276.

[6] Proteomic and Metabolomic Characterization of Corona Virus Disease-19 Patient Sera, 網zhi:medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.07.20054585v1

 

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